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Mensaje por mangostan12 el Lun 08 Ene 2018, 01:59

1- ¿Cómo se secuencia y se ensambla un genoma?
Depende del genoma del organismo que queramos secuenciar; si queremos secuenciar el genoma de un organismo bacteriano utilizamos el sistema 454, que obtiene una menor cantidad de datos; aunque la mayor parte de los programas de secuenciación utilizan el método Illumina. Aunque hay casos en los que se combinan ambos. El procedimiento a seguir es el siguiente:
1. Aislamiento y extracción del ADN de las células del organismo que queremos estudiar, buscando un kit adecuado para la extracción del mismo.
2. Se puede mirar el tamaño del genoma del organismo que queremos secuenciar para determinar el método de secuenciación más apropiado. Si el organismo es nuevo, buscamos otros que sean parecidos filogenéticamente y, si ya existe, buscamos en bibliografía o bases de datos.
3. Fragmentación del ADN. El procedimiento más usado suele ser nebulización, aunque también puede ser mediante ultrasonicación, rotura enzimática, tagmentación… etc.
4. Utilizamos Illumina en la mayor parte de los casos. Estudiamos la cobertura que necesitamos, normalmente cuando el tamaño del genoma del organismo es considerable, utilizamos una cobertura de un valor de 100; si trabajamos con una determinada bacteria (como en prácticas) utilizamos una cobertura de 21. La cobertura va a estar relacionada con el tamaño y la complejidad del genoma de estudio.
5. Cortamos con un cierto tamaño previamente discutido y estudiado y se secuencian. El método de secuenciación puede ser simple (single end) o pareada (paired end), a elegir por el investigador, aunque normalmente es paired end ya que presenta una serie de ventajas frente a la secuenciación simple.
6. Una vez secuenciado, se deberá proceder al ensamblado, aunque antes de esto es recomendable realizar un filtrado de las secuencias usando para ello herramientas bioinformáticas como FASTQC (usada en prácticas). El ensamblador utilizado dependerá del organismo estudiado, ya que se utilizará un ensamblador u otro dependiendo de si el organismo ya ha sido secuenciado anteriormente o no. Se recomienda una búsqueda bibliográfica anterior para elegir el mejor ensamblador, aunque también es altamente recomendable realizar el proceso con varios ensambladores y realizar un consenso final.
7. Una vez elegido el o los ensambladores, se deberán configurar los parámetros del ensamblador en función a las características de la secuenciación, como por ejemplo si ha sido simple o pareada. También se deberá indicar el valor de k-mer si el ensamblador se basa en gráficas De Bruijn. Este valor modificará el resultado del ensamblado, y resulta de interés modificarlo con el objetivo de determinar cuál es el mejor ensamblado.
8. Cabe decir que, con el objetivo de mejorar el ensamblado, se recomienda añadir al programa ensamblador toda la información pertinente a la secuencia del organismo de interés, como por ejemplo un genoma de referencia o el de uno filogenéticamente próximo. Además, el uso de la técnica mate paired permite mejorar el ensamblado del genoma.

2- Ventajas e inconvenientes en los sistemas de tercera generación.
- Ventajas:
o Disminución del trabajo de preparación al no requerir el uso de PCR.
o Requiere una menor cantidad de muestra.
o Secuenciación mucho más larga en algunos sistemas como PacBio llegando incluso a varias kilobases.
o No se realiza amplificación por PCR (con todo lo que ello conlleva):
 No hay errores en forma de mutaciones producidos por la PCR.
 No se generan enriquecimientos no deseados de las muestras.
 Menos problemas con contaminaciones.
 No presenta problemas con bias creados por zonas ricas en GC.
 Analiza cualquier tipo de muestra, incluido la que no se puede amplificar.
 Analiza ADN de mala calidad como el procedente de antiguos restos o muestras forenses.
o Es posible determinar de forma absoluta las isoformas, siendo de especial relevancia en transcriptómica además de en epigenética al detectar modificaciones en bases del ADN.
o Es posible secuenciar directamente el RNA.
o Secuenciación en menor tiempo que los secuenciadores de segunda generación.
o  Cobertura uniforme de la muestra.

- Inconvenientes:
o Puede resultar más caro que los sistemas de segunda generación (actualmente)
o Existe un error aproximado de un 11% debido a inserciones o delecciones (se pueden resolver mediante consenso por cobertura)

mangostan12

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